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 自由流電泳(free flow electrophoresis，F(xiàn)FE)是、F制備型分離技術，具有可連續(xù)分離、多種分離模式、無固體支持介質(zhì)和分離條件溫和等優(yōu)勢，特別適用于生物材料的分離純化和制備。其明顯優(yōu)勢是使大量活性生物材料純品的獲得成為可能。FFE由Barrolier等l和Hannig。于上世紀五六十年代相繼提出，此后20年問有大量的研究報道涉及采用FFE分離和表征免疫細胞、血細胞、骨髓細胞、腎細胞、腫瘤細胞、瘧原蟲、細胞器和細胞膜等“。上世紀90年代中末期，生物技術的飛速發(fā)展對生物材料的分離純化和制備技術的需求日益迫切，F(xiàn)FE具有的優(yōu)越性使其應用更加廣泛，分離樣品涉及小離子、肽、酶和蛋白質(zhì)、核酸、細胞膜、囊泡、細菌、病毒及各種細胞等，并叮用其測量某些物理化學常數(shù)…。FFE儀器也在不斷地被改進更新…，經(jīng)過近50年的發(fā)展，已發(fā)展為傘自動分析儀器，應用范圍從生物

樣品制備發(fā)展到樣品分析及前處理，以及分子生物學、生物化學和細胞生物學等領域。此外，F(xiàn)FE在窄問分離科學、：芒：片技術等方面的應用基礎研究日漸增多，近年來FFE在蛋白質(zhì)組學研究中的應用報道不斷f“現(xiàn)，其作為大量復雜蛋白質(zhì)組分分析的前處理技術以及與其他分析技術聯(lián)用的有關研究正受到廣泛關注。

自由流電泳原理及分離模式

1．1  自由流電泳原理

    Roman等一對FFE分離原理(見圖1)進行了描述。兩塊平行板構(gòu)成的分離竄中，電場與溶液流垂直，電泳遷移率不同的組分在電場作用下與液流方向形成不同的偏轉(zhuǎn)角，在分離室末端不同出11位

置流出。式(1)表示影響偏轉(zhuǎn)角的條件因素。

    圖l  自由流電泳的分離原理

Fig．  i Principle of free flow electrophoresis(FFE t90=一tx．EA／(qw)    (1)

其中，0為偏轉(zhuǎn)角；肛。為帶電離子的電泳遷移率；E

  為電場強度；A為電極表面積；q為分離腔的橫截面

  積；∞為溶液的線速度。

  1．2  自由流電泳分離模式

    (1)自由流區(qū)帶電泳(ZE—FFE)  使用組成相同的溶液使分離室內(nèi)保持恒定的pH和電導值。依據(jù)分析物的質(zhì)荷比，增加電壓可增大組分的電泳遷移率，減小緩沖液流速可增加組分的偏轉(zhuǎn)角，從而增加分離度并提高分辨效率，但可能減小分析通量。

    (2)自由流等電聚焦電泳(IEF—FFE)  利用連續(xù)流動的兩性電解質(zhì)溶液，在分離室內(nèi)的電場方向形成線性pH梯度。樣品隨溶液縱向流動，并在電場作用下發(fā)生橫向偏轉(zhuǎn)，達到其等電點處不再橫向移動，被強制聚焦在某位置，不受擴散和對流的影響，僅在溶液流動方向移動。具有不同等電點的蛋白質(zhì)或肽等兩性物質(zhì)可通過IEF—FFE達到分離。

    (3)自由流等速電泳(ITP—FFE)  選用電泳遷移率最高的前導電解液和遷移率最低的尾隨電解液，在不同的進樣[J同時進樣。因樣品中各組分的電泳遷移率均在前導電解質(zhì)和尾隨電解質(zhì)之間，故使不同遷移率的樣品組分夾在前導電解質(zhì)和尾隨電

解質(zhì)問并按遷移率大小排列得到分離。

    (4)免疫自由流電泳(IMM—FFE)  組分通過特異性免疫反應形成復合體后具有更大的相對分子質(zhì)量(肘，)，且電荷性質(zhì)發(fā)生改變。因此，發(fā)生免疫反應的組分具有與未發(fā)生免疫反應組分不同的質(zhì)荷比，二者在分離室內(nèi)的遷移速度和偏轉(zhuǎn)角度形成差

異而得到分離。

1．3  影響分離的理論因素和實驗條件

1．3．1  影響分離的理論因素

    自由流電泳是一個復雜的動態(tài)分離過程，其中影響分離效率的因素有熱效應、流體力學、電動力學、電動流體力學等。

    (1)熱效應的影響  分離過程中電場產(chǎn)生焦耳熱，使分離室中心和板壁處形成溫度梯度，溶液入口和出H處形成溫度差等。分離過程中采用的分離電壓的高低、電極面積的大小、溶液的性質(zhì)與流速、分離腔的寬度等均會影響熱效應，如式(2)所示。

    H=AE2KtD    (2)

其中，H為焦耳熱；曰為電場強度；A為電極表面積：，c為溶液電導；t為溶液在分離腔內(nèi)的停留時間；D為電極問距離。

    (2)層流和電滲流的影響  分離室具有一定的厚度，使溶液流動時兩板中心處和板壁的流速不同，導致分離室內(nèi)拋物線形液流的出現(xiàn)。處于分離板中心的組分遷移快，板壁處的組分遷移慢，因而導致帶展寬二分離室的厚度越小，層流的影響越大。由于板壁表面還存在雙電層，致使板壁產(chǎn)生由電極一端指向另一端的電滲流，處于板壁處的組分易受電滲

流驅(qū)動，而分離室中心的樣品幾乎不受影響。因此板壁處的組分受相互垂直的板壁阻力和電滲流的影響，在溶液流動方向和電場方向分別受流體力學和電動力學的雙重影響。

    (3)電動流體力學的影響  當樣品溶液的電導與周圍流動溶液的電導存在差異時，電動流體力學的差異將使得樣品區(qū)變形，從而導致帶展寬。Rhodes等。6’7。就此進行了討論，當樣品區(qū)的電導低于周圍流動溶液的電導時，樣品區(qū)出現(xiàn)電場方向的壓縮；反之延展。若分離室內(nèi)所有溶液的電導相同時，則不產(chǎn)生電位梯度，偏轉(zhuǎn)角與溶液的電導無關。

若分離室內(nèi)存在的溶液電導不一致時，將存在電位梯度，組分偏轉(zhuǎn)角受此影響而發(fā)生變化。

1．3．2  影響分離的實驗條件

    自由流電泳分離的分辨率、分離速度等還受多種實驗條件的影響。優(yōu)化分離室設計、控制實驗條件有利于提高分離效率。

    (1)分離室厚度及進樣口徑  適當?shù)姆蛛x室厚度有利于熱擴散，減小熱對流的影響，且避免層流導致的帶展寬。采用問隔0．2～0．5 mm的分離拳，flr獲得好的散熱和分離效果。樣品進樣口徑小，組分對流擴散小，帶展寬小，利于提高分辨率，但降低了分離通量。

    (2)流動溶液的組成和流速  使用低電導溶液產(chǎn)生的焦耳熱低。減小流動溶液與樣品溶液的電導差異可減小組分的帶展寬，提高分辨率。流動溶液流速過大會導致組分在電場中的偏轉(zhuǎn)角減小、分辨率降低，但可使分離室內(nèi)的熱對流影響減小、加快分離速度，提高分離通量。

    (3)分離電壓和電極尺寸  使用高電壓可提高分離速度，但會導致焦耳熱增大、熱對流增加。電極表面積增加會增加電流、增大焦耳熱。

    (4)冷卻系統(tǒng)使用冷卻系統(tǒng)可減小因焦耳熱引起的熱對流和熱不穩(wěn)定因素的影響。分離室外使用冷凝系統(tǒng)是目前控制熱效應采用的主要方法，

    (5)分離室板的表面處理  不同條件下針對不同分離對象，均需考慮電滲流影響。若電滲流對分離不利，可通過對分離板的內(nèi)表面進行惰性化處彈，除去電滲流的影響?

    此外，針對不同的分離樣品，所用緩沖溶液的組成和性質(zhì)、緩沖溶液流速與樣品流速的匹配、樣品入【丁位置、檢測系統(tǒng)等均是需要考慮的影響因素。

2  自由流電泳儀的發(fā)展FFE商用儀器的研制始于20世紀60～70年代

色  的聯(lián)邦德國：…，在其基礎上，第一臺商用儀器Elphor Vap 21面世∞1，其改進型Elphor Vap 22分離室高度為0．5～1．0 mE。蛋白質(zhì)和細胞樣品溶液從5個入口進入分離室，在出口處分流進入90個餾分收集器”1。Hannig等。81最先推出微型化分析型自由流電泳儀(Model ACE 710)，采用小分離室(截面積60 mE 2，分離室長4 cm)，所需樣品量l～5¨L，分離速度30～90 S。該分離系統(tǒng)具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，可使分離和電子光學檢測實現(xiàn)自

動化控制及數(shù)據(jù)圖像實時顯示。Eby 9。曾對多種商用自由流電泳儀進行了總結(jié)。為了克服熱對流、沉降、電滲流等因素的影響，曾出現(xiàn)了許多構(gòu)思獨特的裝置。如Kolin和Luner|1 0]借助磁場作用發(fā)展的不間斷液流區(qū)帶電泳系統(tǒng)是使溶液通過內(nèi)部含冷凝水的圓柱體循環(huán)冷凝。毛細管自由流電泳(CFFE)。11’”1利用了毛細管冷凝系統(tǒng)將Teflon含氟聚合物制備的毛細管緊密排列平鋪在分離腔內(nèi)，當冷凝水通過毛細管時實現(xiàn)熱交換，克服熱對流及

電滲流等的影響。通過增加毛細管冷凝管的層數(shù)，使熱對流對分離幾乎沒有影響。12 mE厚度的分離室使大量樣品組分遠離分離板壁，明顯降低了電滲流．。最具挑戰(zhàn)和創(chuàng)意的想法是利用微重力解決熱對流和沉降問題?？臻g微重力條件可阻止重力相關的熱對流和樣品沉降作用，允許分離室厚度增加，減小電動力學、流體力學因素對分離的影響。前蘇聯(lián)及美、法、日、德等發(fā)達國家研制了空間FFE系統(tǒng)，進行了大量生物材料如蛋白質(zhì)、激素、細胞、脫氧核糖核酸(DNA)等的研究?！薄啊?。我國在上世紀80年代末由中科院空間科學與應用研究中心與微生物所、上海生物化學研究所合作，在“863”計劃和載人航天工程項目資助下，進行了自由流電泳儀A3一l，A3—2樣機的研制2”。2…，用于空間和飛行條件下細胞和蛋白質(zhì)的分離應用研究?！薄?。該樣機在“神舟”四號飛船上進行了微重力條件下的蛋白質(zhì)分離

實驗2“。

    德國是FFE商用儀器最早的生產(chǎn)國，上世紀90年代起市場所見的儀器均產(chǎn)自德國，例如Octoput自由流電泳儀。近年來蛋白質(zhì)組學蓬勃發(fā)展，F(xiàn)FE作為一種分離純化前處理技術重新得到重視。目前針對蛋ft質(zhì)組學研究的全自動FFE商用儀器已經(jīng)面世，但儀器的高售價和分離介質(zhì)的高成本將是國內(nèi)用戶在較長時期要面對的問題。

3  自由流電泳的應用研究及進展

  Hannig…．Bocek 4。和Brown∥分別對FFE的早期研究進行了綜述。本文對FFE近十幾年來的研究進展及應用進行總結(jié)。

3．1  離子、小分子和微粒的分離

    利用FFE分離咖啡中有機酸，發(fā)現(xiàn)了6種新組分i 26。|。不同形態(tài)的Co、Cr、As配合物離子。“J和兩種染料莧菜紅、專利藍在含有毛細管束冷凝系統(tǒng)的分離室得到分離。11i。Martynov和Chrambach等271分離了6種尺度為73～762 RE的帶負電的聚苯乙烯微球，分離室出VI處組分收集序列與微粒的遷移率相關。微球因在電場中的質(zhì)荷比差異導致遷移速度不同，偏轉(zhuǎn)角不同，出口處的位置不同。

3．2多肽和蛋白質(zhì)的分離

    Weber等。2虬提出了連續(xù)流電泳(CFE)，利用CFE等電聚焦和等速電泳模式獲得淀粉葡萄糖苷酶和鼠肝細胞器的高效分離。分離室中等電聚焦高分辨分離模式的實現(xiàn)取決于新型兩性電解質(zhì)的出現(xiàn)和有效的實驗條件控制以便在分離室內(nèi)形成穩(wěn)定的pH梯度㈣。3…。Gavryushkin等、”1從含蜂毒肽、磷酸脂酶、apamin多肽、透明質(zhì)酸酶等組分的蜂蜜樣

品中分離出蜂毒，還從含95％雜蛋白的細胞溶解液中分離出5％的單一蛋白質(zhì)組分，其純度高達90％，產(chǎn)量達20～30 mg／h。Burggraf等?！?。利用等電聚焦分離模式分離純化兩種人細胞溶解液中的蛋白質(zhì)。樣品經(jīng)過等電聚焦分離后可分為80個餾分，餾分問組分的重疊低于30％，為后續(xù)的二維凝膠電泳(2D—GE)、高效液相色譜分析鑒定蛋白質(zhì)提供了有效的前處理方法。FFE分離哺乳動物的垂體后葉素生長激素，可使性質(zhì)相似的變體有效分離，而不同激素的變體被分離在不同餾分中，并表現(xiàn)出不同的活性、”。。鼠肝過氧化物酶體膜上含高比例的堿性蛋白，而目前二維凝膠電泳對于堿性蛋白和高疏水性蛋白的分析有很大的局限。采用IEF—FFE可使膜蛋白七大量的堿性蛋白(等電點pI>10)獲得高分辨的有效分離，并且不發(fā)生沉淀和聚集。分離收集的餾分經(jīng)質(zhì)譜或免疫染色鑒定，其結(jié)果表明，IEF—

FFE可選擇低濃度樣品，使沉淀和聚集作用降低。溶解疏水性蛋白所需的表面活性劑濃度也較低，且低濃度蛋白質(zhì)樣品還可再次進行分離富集。研究表明，IEF—FFE是凝膠電泳和等電聚焦電泳的重要補充，具有一定的優(yōu)越性”1。Schnitzhofer等”j研究了Sclerotium ro的ii菌株CBS350．80中產(chǎn)，￡的多聚半乳糖醛酸酶(PG)，采用IEF—FFE模式對PGl

(M，=39 500，pI=6．5)和PG2(M，=38 000，pI=

5．4)進行制備分離，活性測定回收率達到了96．5％，且在相應pH值處均有高峰出現(xiàn)。FFE與十二烷基

磺酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)聯(lián)用的結(jié)果表明，F(xiàn)FE不僅是一種高分辨率的制備技術，也是一種有效的分析方法。對人血清或血漿進行不完全蛋白質(zhì)組分析時，利用FFE對樣品進行初步分離，再對收集餾分中的一少部分(如16％)樣品與質(zhì)譜聯(lián)用、與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用或與高效液相色譜一電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC—ESI—MS／MS)聯(lián)用，可對樣品中的各種蛋白質(zhì)進行有效鑒定，并可用于對高豐度蛋白質(zhì)的去除和低豐度蛋白質(zhì)的富集。研究

結(jié)果表明，F(xiàn)FE是復雜組分蛋白質(zhì)組研究的一種很有潛力的分析方法一7。3…。

3．3細胞和細胞器分離

    Hannig等‘4 0。的研究表明，在微重力、高電導溶液條件下，兔、豚鼠、大鼠血細胞混合樣品可通過特定的連續(xù)自由流電泳(CFFE)裝置獲得穩(wěn)定的、重復性好的快速分離。因重力對FFE分離過程的影響很大，要獲得高效分離必須克服與重力相關的因素的影響。由于多數(shù)細胞樣品分離后要用于生物學研究，因此FFE分離過程的溶液對細胞性能的影響必須考慮。Bauer等一㈠和Weber等=42j利用分離過程中細胞質(zhì)Ca“含量的變化研究了FFE電解質(zhì)溶液對細胞活性的影響，結(jié)果表明，電解質(zhì)溶液中含50 mmol／L NaCl可提高敏感細胞對分離的兼容性。采用IMM—FFE模式，可將牛腎核內(nèi)體’43：、Hela癌細胞核內(nèi)體。4…、鼠肝過氧化物酶體。44’45 3、鼠肝核內(nèi)體。4 6。與其他細胞器分離。中性白細胞分泌囊泡與質(zhì)膜融合引起各種受體和粘性蛋白傳輸?shù)街行园准毎砻?，F(xiàn)FE可使中性白細胞分泌囊泡蛋白質(zhì)與胞內(nèi)質(zhì)膜蛋白質(zhì)分離4“。三乙醇胺．NaAc一50 mmol／L NaCI。蔗糖混合溶液可使培養(yǎng)的活性外周血淋巴細胞與經(jīng)過輻射誘導的凋亡細胞分離。比較中性以及弱酸性溶液，在弱堿性條件下，凋亡淋巴細胞具有更高的遷移率，說明凋亡淋巴細胞比活性淋巴細胞的

酸性更強。4…。煙草懸浮細胞中的空泡膜或液泡以及質(zhì)膜通過FFE純化可被富集4～5倍，純化后的餾分細胞表現(xiàn)出極其不同的水通透性和水通道活性”。。FFE還可除去酵母粗品中的過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和溶酶體等，使線粒體得以提純和富集：50j，繼而進行蛋白質(zhì)組學分析。

3．4藥物對映體分離

    自由流電泳用于手性物質(zhì)分離的相對較少。Righetti小組”卜”。在早期發(fā)表了固定pH梯度凝膠等電聚焦模式分離丹酰化異亮氨酸、丹酰化苯丙氨酸、丹?；彼岬仁中晕镔|(zhì)的研究結(jié)果。在分離過程中，加入盧-環(huán)糊精(盧一CD)、尿素、甲醇等手性識別劑和添加劑，兩種環(huán)糊精一氨基酸對映體的等電點o]形成o．1pH差異。他們提出可利用固定化膜構(gòu)

成分區(qū)pH梯度電解池實現(xiàn)等電聚焦模式下的對映體分離。Vigh小組。”。則對于加入非電荷手性添加劑可導致的對映體的等電點差值(ApI)大小提出了精確的預測關系式，并指出利用Octopus自由流電泳的等電聚焦模式分離對映體的可行性。通過加入羥丙基巾一環(huán)糊精作為手性識別劑，利用等電聚焦膜形成分區(qū)pH梯度電解池，實現(xiàn)丹?；奖彼岷兔郎惩獙τ丑w的制備54’5“。通過單同分異構(gòu)體和多電荷手性識別劑heptakis．5一sulfato一|B．CD，te卜butaline(特布他林)藥物對映體形成電荷相反但有效遷移率相同的對映體復合物，其在電場中相向移動達到有效分離，提高了有限分離寬度內(nèi)的分辨率。Vigh小組‘“’”1的研究表明，對映體分離可形成制備規(guī)模，回收率可達95％，純度高于99．99％，制備速度可達0．1～2．8 mg／h。

3．5微芯片裝置設計和應用

    Raymond和Manz?！薄?在1994和1996年報道了FFE微型分離系統(tǒng)。他們將25¨L分離腔、雙排125個入口和出口通道、2 500個與電極室隔離的微槽通道集成在硅芯片上。研究表明，樣品分離受溶液電導影響，但焦耳熱影響不明顯，樣品稀釋程度可通過樣品和溶液流速比例控制。硅芯片材料中電滲流導致帶展寬并不明顯，但電極室形成的氣泡可導

致電流中斷，電極室與分離室的開放影響樣品分辨率、停留時間和基線寬度。該系統(tǒng)分離蛋白質(zhì)的通量僅為15斗g／h，遠低于商用系統(tǒng)82 mg／h，但峰保留因子相近，分別為8和10。他們認為，F(xiàn)FE芯片

系統(tǒng)對于樣品量極少的組分分離是理想的選擇，是傳統(tǒng)高通量、連續(xù)制備型FFE的補充。2000年Tja—den等?！?。實現(xiàn)了高效液相色譜與FFE芯片聯(lián)用，完成了熒光標記的生物素與蛋白質(zhì)streptavidin的親和分離。所用芯片材料為光學透明，通過光電倍增管可直接檢測產(chǎn)物的熒光。通過FFE芯片還可去除等電聚焦過程使用的兩性電解質(zhì)，使分離后的

組分可直接進入質(zhì)譜檢測系統(tǒng)。Chartogne等?！癹報道了肌紅蛋白、碳酸酐酶I、盧哥L球蛋白經(jīng)過FFE芯片等電聚焦分離并除去兩性電解質(zhì)后，可成功地與質(zhì)譜聯(lián)用直接進行檢測。所設計的FFE芯片裝置可作為等電聚焦分離與質(zhì)譜檢測聯(lián)用的接口。Shinohara等?！?。和Kobayashi等舊1研究了微型FFE模塊，制得的Pyrex玻璃材料模塊尺寸為66mm×70 mm。在微模塊上集成了7個溶液人口、3個樣品入口、19個出口，在溶液流方向平行安置了

鉑電極。所用芯片材料經(jīng)高分子表面處理可有效地抑制電滲流。分離后的細胞色素C和肌紅蛋白樣品經(jīng)過反相高效液相色譜(RP—HPLC)分析表明分離效果良好。Matsumoto等。“3用計算機流體動力學模擬方法研究_『模塊內(nèi)受電滲流影響的溫度分布情況，使數(shù)字模擬方法對微模塊的設計具有指導意義。Kleparnik等?！?利用偏微分方程描述了芯片分離室內(nèi)流體動力學因素影響的溶液傳輸過程。理論分析表明，樣品注入快速流動的溶液流，可減少樣品的對流和在分離室橫向的擴散系數(shù)，獲得高分辨和快速分離。通過理論計算町獲得微芯片內(nèi)溶液流速、分離室寬度、樣品注入?yún)^(qū)寬度的最優(yōu)解Manz等”J制備r 1．5 mm普通玻璃片覆蓋0．3 mm的聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料為基底的芯片，玻璃一PDMS雜交芯片與微加工技術結(jié)合，可以根據(jù)需要在芯片內(nèi)刻蝕PDMS層分離室通道或反應池，達到等電聚焦、溶液混合、化學合成及組分分離等目的。并町以與質(zhì)譜檢測聯(lián)用。Bowser等”1報道了在多4L@膜--I二陽極鍵合制成Borofloat玻璃基底的FFE微芯片方法。

    FFE芯片對于來源復雜且樣品量不足的生物樣品分析具有一定優(yōu)勢，而通過FFE芯片進行蛋白質(zhì)分離則明顯有利于后續(xù)與質(zhì)譜分析儀器的聯(lián)用。

3．6蛋白質(zhì)組學中的應用

    將人慢性髓性白血病細胞系K562／CR3的細胞液通過自由流等電聚焦模式分離為96個餾分，其等電聚焦的pH范圍為3～12。其中的35個餾分通過胰酶酶解并經(jīng)過液相色譜一質(zhì)譜(LC／MS)分析，可鑒定319種蛋白質(zhì)。6“。FFE分離純化線粒體過程中，蛋白質(zhì)的降解明顯降低，即使用低分辨的2D．GE分析，可鑒定的低豐度蛋白的數(shù)量也增加4倍。FFE純化線粒體蛋白質(zhì)的實驗表明，其他亞細胞蛋白質(zhì)對線粒體蛋白質(zhì)組學分析的干擾明顯降低，可鑒定出129種蛋白質(zhì)。而通過差速離心分離，僅可鑒定出80種蛋白質(zhì)。5“。利用磷酸．絲氨酸特異抗體識別乳腺癌細胞中一種M，為35 000的蛋白質(zhì)時，為了減少細胞液中蛋白質(zhì)組分的復雜性，連續(xù)使用FFE、RP—HPLC、SDS—PAGE三種分離方法后，再對提純的蛋白質(zhì)進行咒一ESI．MS質(zhì)譜鑒定舊]。slmpson和Hoffmann等。7。1對克隆的上皮癌細胞．通過FFE—IEF和SDS-PAGE分離其胞質(zhì)蛋白，并將RP—HPLC與電噴霧離子阱質(zhì)譜聯(lián)用(ESI—IT／MS)進仃鑒定。RP—HPLC和SDS—PAGE聯(lián)用體現(xiàn)了蛋rj質(zhì)pI、疏水性和分子質(zhì)量三維差異，為細胞液中復雜蛋白質(zhì)組分的高通量分離和鑒定提供了有效方法?Moritz和Simpson等”J還通過IEF．FFE，將復雜的蛋白質(zhì)組分分離為96個餾分，并使每份樣品的差異為0·02 pH～0．1 pH。再將96種餾分分別進行快速的RP_HPLC分析(約6 min內(nèi)完成每個單樣分析)，從而構(gòu)成了蛋白質(zhì)等電點和蛋白質(zhì)疏水性二維分離，其一維根據(jù)蛋白質(zhì)等電點分離，二維

根據(jù)蛋白質(zhì)的疏水性分離。再通過軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)研究，使IEF—FFE／RP—HPLC二維分離可視化，，該二維分離具有二維凝膠電泳的圖像效果，其優(yōu)于二維凝膠電泳的是不僅可分離大分子蛋白質(zhì)，同時還司分離凝膠電泳難以分離的小分子肽段7r．該二維分離方法可用于人血漿蛋白質(zhì)組學研究中高豐度蛋白質(zhì)的去除和低豐度蛋白質(zhì)的分析。72,73j。4  展望

    自由流電泳技術已在離子、小分子、手性物質(zhì)、生物大分子等的分離、純化、檢測和鑒定等方面顯示r獨特的優(yōu)勢，具有條件溫和、無基質(zhì)、連續(xù)進樣等特性，在生物大分子的分離制備過程中可最大限度地保持生物分子原有活性，縮短分析制備時問，降低生產(chǎn)成本。自由流電泳還可與其他分離制備手段結(jié)合，產(chǎn)生新的分離技術和方法，如雙水相一自由流電

泳分離。目前，發(fā)展有效的高通量、高分辨蛋白質(zhì)分析技術，盡可能多的獲得蛋白質(zhì)組全蛋白質(zhì)信息，實現(xiàn)高豐度蛋白質(zhì)的去除和低豐度蛋白質(zhì)的分離富集等研究是蛋白質(zhì)組學的前沿領域，也是國內(nèi)外研究者面臨的共同難題。自由流電泳技術用于復雜的蛋

白質(zhì)分離分析具有一定的優(yōu)勢，其作為前處理和預分離技術可與液相色譜、液相色譜一質(zhì)譜、多維色譜一質(zhì)譜、雙向電泳等高分辨分析技術聯(lián)用。自由流電泳芯片技術則具有連續(xù)流和微型化的特點，是點陣式生物芯片和通道式微流控芯片的重要補充?？傊?，傳統(tǒng)的自由流電泳技術將會在生物物質(zhì)分離分析和蛋白質(zhì)組學、生物醫(yī)學等研究領域發(fā)揮重要的