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選購HPLC時(shí)應(yīng)考慮的幾個(gè)常見問題

    HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、預(yù)柱或保護(hù)柱、柱溫控制器等，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型HPLC儀還備有自動(dòng)餾分收集裝置。

    最早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計(jì)算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進(jìn)行梯度洗脫，柱填料從單一品種發(fā)展至幾百種類型，檢測器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確證物質(zhì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜檢測器。數(shù)據(jù)處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是最簡單的積分儀、計(jì)算機(jī)、工作站及網(wǎng)絡(luò)處理系統(tǒng)。

    目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司、Agilent公司（原HP公司）、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等。

一、輸液泵

    輸液泵是HPLC系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其RSD應(yīng)＜0.5%，這對定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10 ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100 ml/min；③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150~300 kg/cm2；④液缸容積?。虎菝芊庑阅芎?，耐腐蝕。

    泵的種類很多，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動(dòng)相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱阻影響；泵壓可達(dá)400kg/cm2。其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（RSD為0.1%左右，串聯(lián)泵為0.2~0.3%），但出故障的機(jī)會(huì)較多（因多一單向閥），價(jià)格也較貴。

二、進(jìn)樣器

    早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器，裝在色譜柱入口處?，F(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器。進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動(dòng)進(jìn)樣。

1．隔膜進(jìn)樣。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價(jià)格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如10MPa以上）；此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到1~2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。

2．停流進(jìn)樣?？杀苊庠诟邏合逻M(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動(dòng)時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)“鬼峰”；另一缺點(diǎn)是保留時(shí)間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。

3．閥進(jìn)樣。一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥（以美國Rheodyne公司的7725和7725i型最常見），其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣（約下降5~10%左右），但耐高壓（35~40MPa），進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（0.5%），操作方便。

4．自動(dòng)進(jìn)樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。

三、色譜柱

色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10μm等，柱效理論值可達(dá)5~16萬/米。對于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達(dá)2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要。

柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達(dá)到最佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術(shù)。即使最好的裝填技術(shù)，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產(chǎn)生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度。在一般的液相色譜系統(tǒng)中，柱外效應(yīng)對柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。

1．柱的構(gòu)造

    色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成，壓力不高于70 kg/cm2
時(shí)，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。為提高柱效，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度，其效果與拋光相同。還有使用熔融硅或玻璃襯里的，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金，孔徑0.2~20μm(5~10μm)，取決于填料粒度，目的是防止填料漏出。

色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：①常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑2~5mm（常用4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm），柱長10~30cm；②窄徑柱（narrow
bore，又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內(nèi)徑1~2mm，柱長10~20cm；③毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn），內(nèi)徑0.2~0.5mm；④半制備柱，內(nèi)徑＞5mm；⑤實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑20~40mm，柱長10~30cm；⑥生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定，目的是為了避免管壁效應(yīng)。

2．柱的發(fā)展方向

    因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長3~10cm，填料粒徑2~3μm。為提高分析靈敏度，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：①節(jié)省流動(dòng)相；②靈敏度增加；③樣品量少；④能使用長柱達(dá)到高分離度；⑤容易控制柱溫；⑥易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。

但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100μl/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。

3．柱的填充和性能評價(jià)

    色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下，填料粒度＞20μm時(shí)，干法填充制備柱較為合適；顆粒＜20μm時(shí)，濕法填充較為理想。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；②徑向加壓法，Waters專利；③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱；④干法。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。

必須指出，高效液相色譜柱的獲得，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理。

    無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對其性能進(jìn)行考察，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下（樣品、流動(dòng)相、流速、溫度）下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù)、對稱因子、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以內(nèi)。進(jìn)行柱效比較時(shí)，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化。一份合格的色譜柱評價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù)，如柱長、內(nèi)徑、填料的種類、粒度、色譜柱的柱效、不對稱度和柱壓降等。